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乳腺癌治疗新发现 | USP11或成为ERα阳性乳腺癌的

大约70%的乳腺癌表达雌激素受体α(ERα),并依赖于这一关键转录调节因子进行增殖和分化。虽然可以通过靶向抗内分泌药物来治疗,但耐药性仍然是一个重大问题,几乎一半的患者最终会复发。

为了阐明ERα的调控机制,进一步加深对乳腺癌的理解,并揭示新的治疗机会。来自爱尔兰皇家外科医学院、都柏林大学、牛津大学、荷兰癌症研究所、隆德大学的研究人员,利用包括蛋白组及泛素化修饰蛋白组在内的研究策略,对去泛素酶 (deubiquitinases, DUB) 在乳腺癌中对ERα的调控机制进行了深入探讨,并于2020年11月在国际权威期刊《Cancer Research》上发表了题为“A functional genomic screen identifies the deubiquitinase USP11 as a novel transcriptional regulator of ERα in breast cancer”的研究成果。

NO.1 研究材料

细胞系:ZR-75-1、T47D、SUM44、MDA-MD-134VI、CAMA-1、MCF7、LCC1、LCC9、HEK293T WT和USP11敲除细胞系。

NO.2 实验路线图

NO.3 研究结果

1、RNAi大规模筛选关键DUBs

为了确定DUBs在乳腺癌细胞内质网转录功能中的作用,研究团队针对人类基因组中所有108个已知或假定的DUBs进行了大规模的RNAi功能缺失筛选。筛选结果发现,USP11是ERα转录活性的调节因子,它的缺失可以负调控ERα的转录活性。

随后研究人员通过评估ERα的直接转录靶标来进一步验证。使用HEK293T USP11敲除细胞来检测USP11功能对ERα活性的影响。结果显示,雌二醇(E2)刺激后,在USP11敲除的细胞中ERα活性被显著抑制,进一步支持了USP11在调节ERα转录活性方面的作用,与RNAi筛选结果一致。

2、雌二醇(E2)增加USP11的表达

接下来,研究人员检测了ERα+乳腺癌细胞株(ZR-75-1、T47D、MCF7、LCC1、LCC9、CAMA-1、MDA-MB-134VI和SUM44)中USP11的表达。结果显示,USP11的表达水平与ERα相关。

那么,USP11的表达是否受到E2调控和4-HT(4- hydoxytamoxifen,雌激素受体ER调节剂)的影响呢?研究人员分别用1 nM E2、1 nM E2+1 μM 4-HT刺激ZR-75-1和MCF7细胞。Western blotting检测显示,两种细胞系的USP11蛋白表达水平在E2暴露后呈时间依赖性增加,4-HT阻断了这种表达变化。对E2处理后USP11的定位进行评估发现,细胞核中USP11的表达上调。

3、蛋白组+泛素化组讨论USP11调控机制

为了进一步探索USP11在ERα转录功能中的关键作用以及E2带来的影响,研究人员分析了E2存在和不存在情况下,USP11基因敲低(shUSP11_1, shUSP11_4)和对照(NTC) ZR-75-1细胞蛋白质组和泛素组的表达差异。结果显示,E2存在时,抑制USP11会显著改变蛋白组和泛素组。

E2存在时,敲低组和对照组中有许多蛋白显著上调。E2缺乏时,USP11对ZR-75-1细胞的蛋白质组没有显著影响。这表明USP11在ZR-75-1细胞中高度依赖E2来行使相应功能。进一步分析在两个敲低组共有的差异表达蛋白发现,缺失的蛋白包括巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)和脂肪酸结合蛋白5 (FABP5)。

随后,研究人员使用shUSP11_1和NTC分析泛素化差异。结果显示,USP11在ERα的功能受到E2的高度调控。在USP11抑制后,USP11底物γH2AX的泛素化增加,支持了之前的结果。USP11沉默后泛素化的蛋白可能是新的底物,E2的存在可能有助于USP11在ERα的转录活性中发挥作用。上述数据表明,USP11是ERα的关键转录因子,其调控作用高度依赖于雌二醇和ERα。

粪便移植实验

4、USP11对ERα活性的影响

为了研究USP11在各细胞系中对ERα转录活性的影响,研究人员检测了靶基因PgR、PKIB和GREB1的mRNA表达。结果显示,在LCC1细胞中,沉默USP11可显著降低ERα靶基因的mRNA表达。

随后,研究人员对USP11敲低细胞(LCC1 siUSP11_1, siUSP11_2, siControl)进行RNA测序(RNA-seq)分析,从而进一步阐明USP11在LCC细胞系中对ERα的转录活性的作用。结果显示,LCC1 USP11敲除细胞周期相关和ERα靶基因受到明显抑制,USP11主要在细胞生长的细胞周期调控中发挥作用。

5、USP11的临床应用潜力

最后,为了确定UPS11作为临床标志物的有效性,研究团队评估了其在ERα+乳腺癌中的预后相关性。基于包括1881例病例数据的GOBO(Gene Expression Based Outcome Online,http://co.bmc.lu.se/gobo/gsa.pl)分析结果显示,USP11高表达与ERα+患者生存期较差显著相关,而在ERα-患者中,USP11的表达和生存率之间没有显著的相关性。

为了支持这些发现,研究团队又对2001-2002年在马尔默大学医院诊断的144例浸润性乳腺癌的肿瘤样本进行了免疫组化分析。在该队列中,USP11高表达与阳性淋巴结状态显著相关。

上述结果表明,USP11的高表达与ERα阳性患者的低生存率显著相关,USP11可能是ERα+乳腺癌的有效预后标志物之一。

NO.4 小编小结

本研究利用RNAi大规模筛选,结合包括蛋白组、泛素化组在内的研究策略,发现了USP11在ERα转录活性调节中的新作用。结合临床队列分析发现,USP11可能可以作为ERα阳性乳腺癌的预后标志物,为ERα阳性乳腺癌的治疗开辟了一条新的途径。

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