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Science子刊| 王红阳院士团队揭示肝内胆管细胞癌

肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是指左右肝管汇合部以上的胆管上皮细胞起源的恶性肿瘤。ICC在成人原发性肝癌中居第二位,约占原发性肝癌患者的10%,且近年来发病率不断增加,慢性炎症和胆道梗阻造成的胆管细胞慢性损伤是胆管细胞癌发病的两个重要因素。ICC恶性程度高、症状隐匿、临床就诊时多属晚期,可手术率低,常规放化疗对ICC的疗效非常有限,在其他肿瘤中已显示明确疗效的靶向治疗、免疫治疗等手段在ICC中也鲜见成功。且ICC预后普遍较差,5年生存率低于5%~10%。因此,寻找新的治疗方法和药物对晚期或复发的肝内胆管癌患者治疗十分急需。

图1. 根据解剖部分胆管癌分型。(引自Liver International. 2019;39(Suppl. 1):7–18.)


9月23日,国家肝癌科学中心王红阳院士团队在国际著名期刊《Science Translational Medicine》(2019年影响因子16.304,5年影响因子18.559)在线发表了题为“PTEN status determines the chemosensitivity to proteasome inhibition in cholangiocarcinoma”的重磅论文。研究发现了明星抑癌分子PTEN在肝内胆管癌的特殊作用,并以此分子机理研究的进展引领了临床精确分型和治疗新策略的应用,为肝内胆管细胞癌治疗带来了新的进展和突破,为无药可用的病人带来了生存希望。王红阳院士团队长期致力于恶性肿瘤的基础与临床研究,尤其在肝胆肿瘤的早期诊断与精准治疗领域有多项创新科研成果和临床应用转化,此项研究是他们在肝内胆管细胞癌研究中取得的又一重要突破。


王红阳院士与研究团队成员合照


作者首先建立了胆管癌患者来源异种移植模型(Patient-derived xenografts,PDXs)并得到PDX来源的细胞(PDX-derived cells,PDCs),应用PDX/PDC库胆管癌原代细胞分离技术在69种FDA批准的抗癌药库中筛选,结果发现硼替佐米(bortezomib,多发性骨髓瘤治疗药物)对PDCs具有强大的细胞毒性作用。


通过对胆管癌细胞系验证发现,不同细胞系对蛋白酶抑制剂的敏感性不同,可分为Bortezomib敏感型和不敏感型两群。选取两种代表性细胞系HCCC-9810(敏感)和RBE(不敏感),转录组学分析发现PI3K-AKT和泛素介导的蛋白水解通路在Bortezomib敏感细胞系HCCC-9810中显著上调,即敏感型细胞系具有更高的蛋白酶体活性。


接下来对高敏感和低敏感细胞进行全基因组测序,对比分析发现,高敏感细胞系HCCC-9810在10号染色体抑癌基因pten所在区段发生断裂丢失,而PTEN是一个著名的抑癌基因,其编码的蛋白可以抑制PI3K-AKT信号。进一步靶向基因的深度测序(平均深度>4000X)发现pten在ICC中存在多种突变,突变病例比例超过40%。非常值得关注的是Bortezomib敏感型细胞系均含有PTEN的突变或者蛋白缺失,而Bortezomib不敏感的细胞系均表达完整的PTEN。

图2. Pten突变缺失的胆管癌对Bortezomib敏感


那么,PTEN对蛋白酶体抑制剂敏感性调节的分子机制是什么?


通过对比Bortezomib敏感和不敏感胆管癌细胞的表达谱,发现泛素-蛋白酶体信号通路在敏感性(PTEN缺失)细胞中异常活化。随后,应用吉凯基因提供的RNA干扰慢病毒和Cas9敲除PTEN慢病毒表达验证了PTEN对蛋白酶体组分表达的调控作用。已有文献报道,26S蛋白酶体组分的表达很大程度上受抗氧化应激反应元件(ARE)调节,其中ARE相关蛋白NRF1和NRF2是最重要的两个转录因子。目前,PTEN与NRF1及NRF2的相关性尚不明确,PTEN与ARE其它转录因子关系的报道几乎没有。随后的实验证实PTEN对ARE转录活性具有调节作用,但是这种作用不依赖于NRF1/2。针对参与ARE转录调控的因子,我们做了逐个验证,发现BACH1和MAFF是两个参与PTEN对蛋白酶体表达和活性调节的主要因子。当BACH1和MAFF表达增加时,胆管癌细胞对Bortezomib的反应性显著下降,而敲低它们则会提高药物的敏感性。抑制BACH1和MAFF也会减弱PTEN对蛋白酶体水解活性的抑制作用和ARE转录活性。进一步研究揭示,PTEN-PI3K-AKT-FOXO1信号轴调节BACH1和MAFF的转录表达,FOXO1直接结合到两个基因的启动子区发挥转录调节作用。在PTEN缺失的细胞里,AKT具有较高的活性,FOXO1被屏蔽在细胞质中,这时BACH1和MAFF表达水平很低,蛋白酶体组分基因的转录抑制解除。因而,相比于PTEN野生型细胞,缺失型细胞具有更高的蛋白合成速率和更高的蛋白酶体活性,当应用蛋白酶体抑制剂时大量蛋白发生聚集,肿瘤细胞因蛋白毒性应激而死亡。


图3. PTEN通过PI3K-AKT-FOXO1途径调节Bach1/MAFF转录调控蛋白酶体组分表达


为了给胆管癌提供更好的研究工具,课题组构建了基于PTEN缺失的ICC自发动物模型。应用PTEN敲除小鼠和Kras小鼠进行杂交,可以得到Kras PTEN Alb-CRE 小鼠。小鼠出生后8周即出现腹部膨胀、严重腹水、胆囊肿大、胆管梗阻、肝上出现肿瘤等表现。病理学检测谱系标志物确认其为胆管癌(Cancer Lett. 2018 May 1;421:161-169.)。应用这一自发胆管癌模型,课题组对发现的多个基因的功能进行了研究。例如,他们发现敲除RMP基因强烈抑制ICC发生发展。RMP通过其蛋白分子中D2区域竞争性结合KEAP1蛋白分子中Kelch区域,减少NRF2蛋白降解,从而提高细胞存活和抗氧化能力。该研究阐明了ICC发生过程中肿瘤细胞如何获得生存能力的可能机制。这一部分内容发表于Hepatology杂志(Hepatology. 2020 Jun;71(6):2005-2022.)。

图4. RMP通过竞争性结合KEAP1稳定NRF2蛋白


依据良好的临床前研究数据,课题组申请开展了应用蛋白酶体抑制剂Bortezomib进行疗效观察的临床研究(NCT03345303)。运用分子靶向抑制药物和常规化疗药物,治疗显示不同PTEN类型的胆管癌病人,确定基于PTEN分子分型的胆管癌治疗新策略新方案;展开基于不同PTEN背景的胆管癌临床研究工作,观察和评价制定的化疗方案对病人的治疗效果。该工作既为研发胆管癌新药提供新的靶点,也为患者带来针对性治疗和延长生存的福音。


1. 基于PDXs/PDCs药物筛选技术,发现蛋白酶体抑制剂在PTEN缺陷型胆管癌具有显著疗效。机制研究发现PTEN-AKT-FOXO1-BACH1/MAFF通路可介导蛋白酶体基因的转录抑制,并赋予了肿瘤对蛋白酶体抑制剂硼替佐米治疗的抗性;


2. GDSC,CTRP,CCLE和TCGA数据库分析结果显示:PTEN缺陷使多种肿瘤对蛋白酶体抑制治疗敏感,这或将对多种肿瘤的治疗具有重要意义;


3. 硼替佐米Bortezomib是目前临床治疗多发性骨髓瘤的一线靶向药物,药物安全性有保障。若该治疗策略在临床研究中可以得到证实,将会为众多肿瘤患者的治疗带来新的选择。

用于敲减和敲除PTEN的慢病毒由吉凯基因提供,感染肿瘤细胞系(感染参数:polybrene 4 μg/ml;puromycin筛选浓度2 μg/ml)48h后进行蛋白表达水平验证,结果显示PTEN 蛋白表达明显下调。


载体及靶点:

PTEN干扰慢病毒载体hU6-MCS-CMV- Puromycin,干扰靶点5′-CCACAGCTAGAACTTATCAAA-3′ (shPTEN#1)和5′-AAGTGCCTCGTTTCCTTTAA-3′ (shPTEN#2, for 3′UTR)。


PTEN CRISPR KO 慢病毒载体hU6-sgRNASV40-EGFP vectors,靶点sg#7401: 5′-ACCGCCAAATTTAATTGCAG-3′和sg#7403: 5′-ACGCCTTCAAGTCTTTCTGC-3′。

Western blotting结果显示慢病毒感染后PTEN蛋白表达明显下调


作者简介


上海东方肝胆外科医院/国家肝癌科学中心王红阳院士、谈冶雄教授、董立巍教授为论文共同通讯作者,研究生蒋添翼和潘宇飞、万正华博士为共同第一作者。该研究得到国家科技部、国家自然科学基金委和上海市科委等项目经费支持。课题组依托于东方肝胆外科医院和国家肝癌科学中心的国科金创新群体,教育部和上海市重点实验室平台的支撑。


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